拷贝数变异测序
拷贝数变异测序（Copy Number Variation Sequencing, CNV-seq）是一种基于高通量测序技术，用于检测基因组中DNA拷贝数变异（CNV）的分子生物学方法。CNV是指基因组中大于1kb的DNA片段的拷贝数增加或减少，包括缺失、重复、插入等结构变异，是基因组结构变异的重要组成部分。CNV测序技术通过对全基因组或目标区域进行深度测序，结合生物信息学分析，能够高精度地识别CNV的位置、大小和拷贝数变化，为疾病诊断、基因功能研究和进化分析提供重要信息。
技术发展历程
早期CNV检测技术
早期CNV检测主要依赖于荧光原位杂交（FISH）、比较基因组杂交（CGH）和基于微阵列的比较基因组杂交（aCGH）等技术，但这些方法分辨率有限，无法检测小片段的CNV。
基于NGS的CNV检测
随着二代测序技术（NGS）的出现，基于测序深度的CNV检测方法逐渐发展，通过计算特定区域的测序reads数量与参考基因组的比对情况，实现CNV的检测，大大提高了分辨率和准确性。
生物信息学工具的发展
多种CNV分析算法和工具相继开发，如CNVnator、CNVkit、Control-FREEC等，能够处理不同测序平台产生的数据，并针对不同类型的样本（如肿瘤、胚胎等）进行优化。
三代测序技术的应用
三代测序技术（如PacBio、Nanopore）的发展，提供了更长的读长和更高的结构变异检测能力，进一步推动了CNV检测技术的发展。
基本原理
测序深度与拷贝数关系
CNV测序的核心原理是基于测序深度（Read Depth, RD）与基因组拷贝数的线性关系。在理想情况下，基因组中每个区域的测序reads数量与该区域的拷贝数成正比。通过比较样本与参考基因组或对照样本的测序深度差异，可以推断出CNV的存在及其拷贝数变化。
断点检测
除了基于测序深度的方法，CNV测序还可以通过检测断裂点（Breakpoints）来识别CNV。当基因组发生结构变异时，会在断点处产生异常的测序reads比对模式，如跨断裂点的嵌合reads（Split Reads）或异常的配对末端reads（Paired-End Reads）距离，这些特征可用于精确定位CNV的边界。
生物信息学分析流程
CNV测序的生物信息学分析流程通常包括：原始数据质量控制、reads比对到参考基因组、测序深度标准化、CNV区域识别、断点精确定位、CNV注释和功能分析等步骤。
CNV测序技术类型
全基因组测序（WGS）
对整个基因组进行测序，能够检测全基因组范围内的CNV，分辨率取决于测序深度，通常为1-10kb。适合发现未知CNV和复杂结构变异。
外显子组测序（WES）
选择性捕获和测序基因组中的外显子区域，对编码区CNV检测具有较高的灵敏度和性价比，但无法检测非编码区的CNV。
目标区域测序
针对特定基因或区域进行深度测序，适合已知致病CNV的验证或特定疾病相关CNV的筛查，成本低、灵敏度高。
低覆盖度全基因组测序
以较低的测序深度（通常1-5X）对全基因组进行测序，通过增加样本量和统计分析来检测CNV，适合大规模人群CNV研究。
数据分析方法
基于测序深度的方法
通过计算基因组区域的测序reads数量，与参考基因组或对照样本进行比较，识别拷贝数变化区域。常用工具包括CNVnator、CNVkit、ExomeDepth等。
基于断裂点检测的方法
通过分析异常比对的reads（如split reads和abnormal paired-end reads）来识别CNV的断裂点，精确定位CNV边界。常用工具包括Pindel、Delly等。
基于单核苷酸多态性（SNP）的方法
通过分析SNP位点的等位基因频率，识别杂合性缺失（LOH）和拷贝数中性的杂合性丢失（cnLOH）。常用工具包括PennCNV、QuantiSNP等。
整合多种信号的方法
结合测序深度、断裂点和SNP信息，提高CNV检测的准确性和分辨率。常用工具包括Manta、Lumpy等。
技术优势与挑战
优势
- 高分辨率：可检测小至几十bp的CNV，远高于传统方法
- 全基因组覆盖：能够检测全基因组范围内的CNV，包括编码区和非编码区
- 精确定位：可准确确定CNV的断裂点位置，提供详细的结构信息
- 同时检测多种变异：除CNV外，还可检测SNP、插入缺失（Indel）等变异
- 适用于多种样本类型：包括血液、组织、细胞系、FFPE样本等
挑战
- 数据分析复杂：需要专业的生物信息学知识和工具来处理高维数据
- 假阳性和假阴性：测序深度不均一、重复序列区域等因素可能导致误判
- 低水平嵌合CNV检测困难：肿瘤样本中的亚克隆CNV或体细胞嵌合变异检测灵敏度有限
- 成本较高：全基因组测序成本相对较高，限制了大规模应用
- CNV功能注释困难：许多CNV的临床意义和功能尚未明确
应用领域
遗传病诊断
CNV测序可检测染色体微缺失/微重复综合征、单基因病相关的CNV，如杜氏肌营养不良症（DMD）、脊髓性肌萎缩症（SMA）等。
肿瘤基因组学
检测肿瘤相关的CNV，如原癌基因扩增（如HER2）、抑癌基因缺失（如TP53），为肿瘤的诊断、预后评估和靶向治疗提供依据。
产前诊断
通过无创产前检测（NIPT）分析母血中的游离胎儿DNA，检测胎儿染色体非整倍体和大片段CNV。
药物基因组学
检测药物代谢相关基因的CNV，如CYP450家族基因，指导个性化用药。
进化与群体遗传学
研究物种间和群体内的CNV差异，了解基因组进化和适应性。
技术流程
样本制备
提取高质量的基因组DNA，确保DNA浓度和完整性符合测序要求。
文库构建
将DNA片段化，连接测序接头，根据测序目标选择全基因组、外显子组或目标区域捕获。
测序
使用高通量测序平台（如Illumina、PacBio、Nanopore）进行测序，生成原始测序数据。
数据分析
包括数据质量控制、比对、CNV检测、注释和功能分析等步骤。
结果验证与解读
通过Sanger测序、qPCR、MLPA等方法验证CNV，结合临床表型进行功能和临床意义解读。
常用工具与数据库
分析工具
- CNVnator - 基于全基因组测序数据的CNV检测工具
- CNVkit - 用于外显子组和目标区域测序的CNV检测工具
- Control-FREEC - 用于肿瘤样本的CNV和LOH检测工具
- Genome STRiP - 基于全基因组测序的结构变异检测工具
- Manta - 用于检测插入缺失和结构变异的工具
数据库
- DECIPHER - 与疾病相关的CNV和表型数据库
- dbVar - NCBI的基因组结构变异数据库
- GWAS Catalog - 全基因组关联研究数据库
- ClinVar - 与疾病相关的基因变异数据库
- Database of Genomic Variants (DGV) - 正常人群CNV数据库
