荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）是一种利用荧光标记的核酸探针与染色体或DNA片段进行杂交，从而检测和定位特定DNA序列的分子细胞遗传学技术。该技术结合了分子生物学和细胞学方法，能够在不破坏细胞结构的前提下，直观地显示目标DNA在染色体上的位置。FISH技术自20世纪80年代发展以来，已广泛应用于染色体异常检测、基因定位、肿瘤遗传学研究和产前诊断等领域。
基本原理
核酸杂交
FISH基于核酸分子碱基互补配对的原理，用荧光素标记的DNA探针与变性后的染色体或DNA片段杂交，形成稳定的杂交体，通过荧光显微镜观察荧光信号的位置和强度，确定目标序列的存在和分布。
荧光标记
探针可以直接用荧光素标记（直接法FISH），或用半抗原（如生物素、地高辛）标记后，再通过荧光素偶联的抗体进行检测（间接法FISH）。
信号检测
杂交后，通过荧光显微镜或共聚焦显微镜观察荧光信号，结合图像处理软件分析信号的数量、位置和强度。
技术流程
1. 样本制备
制备染色体标本或组织切片，常用的样本包括外周血淋巴细胞、羊水细胞、绒毛膜细胞、肿瘤组织等。样本需固定在载玻片上，保持细胞结构完整。
2. 探针设计与标记
根据研究目的设计特异性DNA探针，探针长度通常为100-1000个碱基对。探针可通过缺口平移、随机引物法或PCR等方法用荧光素或半抗原标记。
3. 变性
将样本DNA和探针同时或分别进行变性处理，使双链DNA解旋为单链，以便探针与目标序列杂交。常用方法包括热变性和化学变性。
4. 杂交
在适当的温度和盐浓度下，探针与样本DNA进行杂交，形成稳定的DNA-DNA双链结构。杂交时间通常为16-24小时。
5. 洗片
杂交后，通过严格的洗涤步骤去除未结合的探针和非特异性杂交信号，保留特异性杂交体。
6. 信号检测与分析
用荧光显微镜观察杂交信号，根据探针的荧光颜色和位置判断目标序列的存在和状态。通常需要观察多个细胞以获得可靠结果。
探针类型
1. 染色体涂染探针
覆盖整条染色体或染色体臂的探针混合物，用于检测染色体数目异常、易位和重排等结构异常。
2. 着丝粒探针
针对染色体着丝粒区域的重复序列，用于检测染色体数目异常（如非整倍体）。
3. 位点特异性探针
针对特定基因或DNA片段的探针，用于检测基因扩增、缺失或易位（如HER2基因扩增、BCR-ABL融合基因）。
4. 端粒探针
针对染色体端粒区域的探针，用于检测端粒长度变化和染色体末端异常。
5. 多色FISH探针
使用多种不同荧光素标记的探针组合，可同时检测多个目标序列，用于复杂染色体异常的分析。
6. 比较基因组杂交(CGH)探针
用于全基因组范围内检测DNA拷贝数变化，比较样本DNA与参考DNA的相对拷贝数。
技术特点
优势
- 高特异性：可精确检测特定DNA序列的位置和拷贝数
- 多色标记：可同时使用多种荧光探针，检测多个目标序列
- 细胞水平分析：可在保持细胞形态的前提下进行DNA分析
- 灵敏度高：可检测低拷贝数的目标序列
- 适用样本广泛：包括新鲜组织、石蜡包埋组织、细胞涂片等
- 结果直观：荧光信号可直接在显微镜下观察和分析
局限性
- 分辨率限制：通常只能检测大于100kb的DNA片段
- 探针设计复杂：需要针对特定目标序列设计和制备探针
- 技术要求高：操作步骤多，需要严格控制实验条件
- 不能提供全基因组信息：只能检测预先设计的目标序列
- 荧光信号易淬灭：需要及时观察和拍照记录结果
临床应用
产前诊断
检测胎儿染色体数目异常（如唐氏综合征、爱德华兹综合征）和微缺失综合征（如22q11.2微缺失）。
肿瘤遗传学诊断
检测肿瘤相关基因的异常，如HER2基因扩增（乳腺癌）、BCR-ABL融合基因（慢性粒细胞白血病）、MYCN扩增（神经母细胞瘤）等。
血液系统疾病诊断
检测白血病和淋巴瘤中的染色体易位和基因重排，如t(14;18)（滤泡性淋巴瘤）、t(8;14)（Burkitt淋巴瘤）等。
遗传疾病诊断
检测基因缺失或重复导致的遗传性疾病，如杜氏肌营养不良、Prader-Willi综合征等。
药物疗效预测
通过检测特定基因的状态，预测肿瘤患者对靶向治疗的反应，如HER2 FISH检测指导曲妥珠单抗治疗。
微生物检测
检测和鉴定病原微生物，如细菌、病毒和真菌，特别是难以培养的病原体。
衍生技术
光谱核型分析(SKY)
用24种不同荧光标记的染色体涂染探针，同时检测所有染色体，用于复杂染色体异常的分析。
多色FISH(M-FISH)
与SKY类似，但使用不同的荧光组合和图像处理技术，用于染色体数目和结构异常的检测。
比较基因组杂交(CGH)
全基因组范围内检测DNA拷贝数变化，比较样本DNA与参考DNA的相对拷贝数，用于肿瘤基因组分析。
RNA FISH
检测和定位细胞内RNA分子，用于基因表达分析和RNA定位研究。
间期FISH
直接在未分裂的细胞核中进行FISH分析，适用于快速检测染色体异常。
DNA纤维FISH
将DNA分子拉伸成线性纤维后进行FISH，用于高分辨率分析DNA序列的排列和结构。
与其他技术的比较
| 技术 | 分辨率 | 通量 | 细胞水平分析 | 主要应用 |
|---|---|---|---|---|
FISH | 100kb-1Mb | 单个或少数位点 | 是 | 染色体异常、基因定位 |
CGH阵列 | 1-100kb | 全基因组 | 否 | 拷贝数变异检测 |
核型分析 | 5-10Mb | 全基因组 | 是 | 染色体数目和结构异常 |
NGS | 单碱基 | 全基因组 | 否 | 基因突变、拷贝数变异 |
参考文献
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