多重连接探针扩增技术
多重连接探针扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA）是一种基于核酸杂交和PCR扩增的高通量基因拷贝数分析技术。该技术由荷兰学者Schouten于2002年开发，能够在单一反应中同时检测多达50个不同DNA序列的拷贝数变化，广泛应用于染色体数目异常、基因缺失/重复、甲基化分析等领域。
基本原理
探针设计
MLPA探针由两个部分组成：左侧探针和右侧探针，分别与目标DNA序列相邻区域杂交。每个探针包含特异性杂交序列和通用引物结合序列。
连接反应
当两个探针与目标序列完美杂交后，DNA连接酶将它们连接成一个完整的DNA分子。未杂交或错配的探针不会被连接。
PCR扩增
连接后的探针通过一对通用引物进行PCR扩增，扩增产物的量与目标序列的拷贝数成正比。
检测与分析
扩增产物通过毛细管电泳分离，根据峰高或峰面积计算各目标序列的相对拷贝数，与参考样本比较后判断是否存在拷贝数变异。
技术流程
1. 样本DNA制备
提取高质量基因组DNA，浓度和纯度需满足实验要求。DNA片段长度应大于探针杂交区域长度。
2. 探针杂交
将MLPA探针混合物与样本DNA变性后杂交，探针特异性结合到目标序列上。
3. 连接反应
加入DNA连接酶，连接相邻的左侧和右侧探针，形成完整的可扩增模板。
4. PCR扩增
使用荧光标记的通用引物对连接产物进行扩增，不同探针的扩增产物长度不同。
5. 毛细管电泳分析
扩增产物通过毛细管电泳分离，荧光信号由测序仪检测，生成峰图。
6. 数据处理与解读
通过专用软件分析峰高或峰面积，计算样本与参考标准的比值，判断拷贝数变化。
技术特点
优势
- 高通量：单反应可同时检测50-60个目标序列
- 高灵敏度：可检测低至10%的拷贝数变化
- 所需DNA量少：仅需50-200ng基因组DNA
- 操作简便：无需设计大量引物，实验流程标准化
- 应用广泛：适用于多种样本类型，包括FFPE组织
局限性
- 只能检测已知序列的拷贝数变化，无法发现新的变异
- 无法区分纯合缺失和样本DNA质量问题
- 对样本DNA质量要求较高，降解DNA可能影响结果
- 探针设计复杂，商品化探针价格较高
探针设计与类型
探针设计原则
MLPA探针需满足以下条件：特异性杂交序列长度为40-60bp，扩增产物长度相差至少5bp以避免峰重叠，GC含量适中以保证杂交效率。
探针类型
- 标准探针：用于检测基因拷贝数变化
- SNP探针：用于检测单核苷酸多态性
- 甲基化特异性探针：用于分析DNA甲基化状态
- mRNA探针：用于检测RNA表达水平
临床应用
染色体数目异常检测
用于检测染色体非整倍体（如唐氏综合征、爱德华兹综合征）和微缺失/微重复综合征（如Prader-Willi综合征、DiGeorge综合征）。
基因拷贝数变异分析
检测遗传性疾病相关基因的缺失或重复（如DMD基因在杜氏肌营养不良中的突变）、肿瘤相关基因的扩增（如HER2在乳腺癌中的扩增）。
甲基化分析
通过MS-MLPA（Methylation-Specific MLPA）技术检测基因甲基化状态，用于印记基因疾病（如Beckwith-Wiedemann综合征）和肿瘤表观遗传学研究。
病原体检测
检测病毒载量（如HIV、HBV）和病原体分型（如HPV分型）。
基因表达分析
通过RT-MLPA（Reverse Transcription MLPA）技术检测特定mRNA的表达水平，用于基因表达谱分析和融合基因检测。
与其他技术的比较
| 技术 | 通量 | 分辨率 | 样本要求 | 成本 |
|---|---|---|---|---|
MLPA | 50-60个靶点/反应 | 单个外显子水平 | 50-200ng DNA | 中等 |
qPCR | 1-10个靶点/反应 | 基因水平 | 10-100ng DNA | 低 |
微阵列 | 数百万个探针/芯片 | 1-10kb | 500-1000ng DNA | 高 |
NGS | 全基因组/外显子组 | 单碱基水平 | 100-1000ng DNA | 高 |
技术改进与衍生方法
SALSA MLPA
（Semi-automated Ligase-dependent Probe Amplification）：商业化MLPA技术，提供标准化试剂盒，操作更简便。
MS-MLPA
（Methylation-Specific MLPA）：在MLPA基础上加入甲基化敏感的限制性内切酶，用于分析DNA甲基化状态。
RT-MLPA
（Reverse Transcription MLPA）：用于RNA分析，可检测mRNA表达水平和融合转录本。
MALDI-TOF MLPA
结合质谱技术的MLPA，可实现更高通量的检测和SNP分析。
参考文献
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