聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种体外酶促扩增特定DNA片段的分子生物学技术，由美国科学家凯利·穆利斯（Kary Mullis）于1983年发明。PCR技术可在短时间内将微量的DNA模板扩增数百万倍，具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，被誉为分子生物学领域的革命性技术。该技术广泛应用于基因克隆、基因测序、基因表达分析、疾病诊断、法医鉴定、考古研究等多个领域。
发展历程
1983年 - PCR技术诞生
凯利·穆利斯（Kary Mullis）在Cetus公司工作期间发明了PCR技术，最初使用大肠杆菌DNA聚合酶进行反应，需要在每次变性步骤后添加新的酶。
1986年 - Taq DNA聚合酶的应用
从嗜热水生菌（Thermus aquaticus）中分离出的Taq DNA聚合酶被引入PCR反应，该酶具有耐高温的特性，使PCR自动化成为可能。
1988年 - 自动化热循环仪
第一台自动化PCR热循环仪（DNA Thermal Cycler）问世，大大提高了PCR反应的效率和可重复性。
1993年 - 诺贝尔奖
凯利·穆利斯因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖，以表彰他对分子生物学领域的重大贡献。
后续发展
实时荧光定量PCR（qPCR）、逆转录PCR（RT-PCR）、巢式PCR等技术相继出现，进一步扩展了PCR技术的应用范围。
基本原理
PCR技术的基本原理是模拟DNA在体内的复制过程，通过温度循环控制，在体外实现DNA的指数级扩增。整个过程主要包括三个步骤：
变性（Denaturation）
将反应体系加热至94-98°C，使双链DNA模板解旋为单链，为引物结合做准备。
退火（Annealing）
将温度降低至50-65°C，使设计的特异性引物与单链DNA模板互补结合。
延伸（Extension）
将温度升至72°C，DNA聚合酶以dNTPs为原料，从引物的3'端开始合成新的DNA链。
这三个步骤组成一个循环，每完成一个循环，DNA模板的拷贝数就增加一倍。通常经过25-40个循环，可将目标DNA片段扩增至数百万倍。
PCR反应体系
1. DNA模板
含有目标DNA序列的样本，可以是基因组DNA、质粒DNA、cDNA等。模板DNA的质量和纯度对PCR反应的成功至关重要。
2. 引物（Primers）
一对寡核苷酸序列，分别与目标DNA片段的两条链互补。引物的设计需要考虑长度、GC含量、Tm值、避免二级结构和引物二聚体等因素。
3. DNA聚合酶
常用的是Taq DNA聚合酶或其衍生物，具有耐高温的特性，能够在多次高温变性步骤中保持活性。高保真DNA聚合酶（如Pfu、Phusion等）用于需要高准确性的应用。
4. dNTPs
四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），是DNA合成的原料。
5. 缓冲液（Buffer）
提供合适的pH值和离子强度，通常含有Tris-HCl、KCl和MgCl₂等成分。Mg²⁺浓度对DNA聚合酶的活性和特异性有重要影响。
6. 其他添加剂
根据需要可添加BSA、DMSO、甘油等添加剂，以提高PCR反应的效率和特异性。
PCR技术类型
实时荧光定量PCR（qPCR）
在PCR反应体系中加入荧光基团，通过监测荧光信号的累积实时测定PCR进程，实现对模板DNA的定量分析。常用的荧光化学方法包括SYBR Green I染料法和TaqMan探针法。
逆转录PCR（RT-PCR）
以RNA为模板，先通过逆转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。常用于基因表达分析、RNA病毒检测等。
巢式PCR（Nested PCR）
使用两对引物进行两轮PCR扩增，第一轮扩增产物作为第二轮扩增的模板。该方法可以提高PCR的灵敏度和特异性，适用于低丰度模板或复杂样本的检测。
随机引物PCR（RAPD）
使用随机设计的短引物（通常为10个碱基）对基因组DNA进行扩增，产生多个DNA片段。该方法无需预先知道模板序列信息，常用于遗传多样性分析和分子标记开发。
多重PCR（Multiplex PCR）
在同一反应体系中使用多对引物，同时扩增多个目标DNA片段。该方法常用于病原体分型、基因突变检测和STR分析等。
甲基化特异性PCR（MSP）
先使用亚硫酸氢盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，然后设计特异性引物进行PCR扩增，检测DNA甲基化状态。
技术特点
优势
- 高灵敏度：可从极微量的DNA模板（甚至单个细胞）中扩增出足够的DNA
- 高特异性：通过设计特异性引物，可选择性扩增目标DNA片段
- 快速高效：几个小时内可完成数十个循环，实现DNA的指数级扩增
- 操作简便：自动化热循环仪的使用使PCR操作变得简单易行
- 应用广泛：适用于基因克隆、测序、表达分析、突变检测等多种研究
- 灵活性高：可通过调整反应条件和引物设计适应不同的研究需求
局限性
- 引物设计要求高：需要精确设计引物，否则可能导致非特异性扩增
- 污染风险：极微量的DNA污染可能导致假阳性结果
- 对模板质量敏感：降解或污染的DNA模板可能影响扩增效率
- 扩增片段长度限制：通常适用于扩增较短的DNA片段（一般<3kb）<>
- 无法定量初始模板：常规PCR只能进行定性分析，需要qPCR进行定量
- GC-rich区域困难：高GC含量区域可能导致扩增效率降低
应用领域
病原体检测
用于检测病毒、细菌、真菌等病原体，如新冠病毒（SARS-CoV-2）核酸检测、HIV检测、HPV分型等。
遗传病诊断
检测遗传性疾病相关的基因突变，如地中海贫血、囊性纤维化、亨廷顿舞蹈病等。
癌症研究
检测癌基因、抑癌基因的突变和表达水平，用于癌症的早期诊断、预后评估和靶向治疗指导。
法医鉴定
通过STR分型等技术进行DNA指纹分析，用于亲子鉴定、犯罪现场物证鉴定等。
分子进化研究
扩增和分析不同物种的保守基因序列，研究生物进化关系和系统发育。
基因克隆与表达
扩增目的基因片段，用于构建重组DNA分子和基因表达载体。
基因编辑
扩增sgRNA模板或用于验证CRISPR/Cas9等基因编辑技术的编辑效果。
经典文献
- 1. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987;155:335-350.
- 2. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988;239(4839):487-491.
- 3. Holland PM, Abramson RD, Watson R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(16):7276-7280.
- 4. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402-408.
- 5. Dieffenbach CW, Dveksler GS, eds. PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1995.
