第一代测序技术
第一代测序技术是指自20世纪70年代发展起来的DNA测序技术，主要包括Sanger测序法（双脱氧链终止法）和Maxam-Gilbert化学降解法。其中，Sanger测序法因其操作简便、准确性高而成为最常用的测序技术，并在人类基因组计划（HGP）中发挥了核心作用。第一代测序技术为现代分子生物学研究奠定了基础，是基因克隆、突变检测、序列验证等实验的金标准。
发展历程
1977年 - Sanger测序法诞生
Frederick Sanger和Alan R. Coulson发明了双脱氧链终止法，首次实现了DNA序列的快速测定，这一方法后来成为最主流的测序技术。
1977年 - Maxam-Gilbert测序法
Allan Maxam和Walter Gilbert发明了化学降解法，通过化学修饰和降解DNA来确定序列，但该方法操作复杂，后来较少使用。
1986年 - 自动化测序仪
Leroy Hood开发了第一台自动化DNA测序仪，采用荧光标记代替放射性标记，大大提高了测序效率。
1990-2003年 - 人类基因组计划
Sanger测序法作为主要技术手段，完成了人类基因组的测序工作，标志着基因组学时代的到来。
核心技术
Sanger测序法
基于DNA聚合酶的链终止原理，利用双脱氧核苷酸（ddNTP）终止DNA链的延伸。通过在四个独立反应中分别加入四种带有放射性或荧光标记的ddNTP，生成不同长度的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，通过放射自显影或荧光检测读取DNA序列。
Maxam-Gilbert测序法
基于化学修饰和降解DNA的原理，将DNA片段末端标记后，分别用不同的化学试剂对特定碱基进行修饰和切割，生成不同长度的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，通过放射自显影读取DNA序列。该方法因操作复杂、使用有毒化学试剂而逐渐被Sanger法取代。
Sanger测序流程
1. 模板制备
从生物体中提取DNA，通过PCR扩增或克隆到载体中，获得足够量的待测序DNA模板。
2. 测序反应
在四个独立的反应体系中，加入DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs和少量带有放射性或荧光标记的ddNTP。DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链，当ddNTP掺入时，链延伸终止，生成一系列不同长度的DNA片段。
3. 电泳分离
将反应产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳进行分离，DNA片段按长度排列。
4. 序列检测与读取
如果使用放射性标记，通过放射自显影片段的位置确定碱基序列；如果使用荧光标记，通过激光激发荧光信号，由测序仪自动读取序列。
5. 数据分析
使用测序分析软件对原始数据进行处理，去除引物序列和低质量区域，生成最终的DNA序列。
技术特点
优势
- 高准确性：单碱基准确率超过99.9%，是验证测序的金标准
- 长读长：可获得800-1000bp的连续序列，适合分析重复区域
- 操作简单：实验流程相对简单，不需要复杂的仪器设备
- 灵活性高：适用于各种DNA模板，包括PCR产物、BAC克隆等
- 应用广泛：常用于基因突变检测、序列验证、SNP分型等
局限性
- 通量低：一次只能分析少量样本，不适合大规模测序
- 成本高：每个碱基的测序成本相对较高
- 耗时：从样本制备到获得结果需要较长时间
- 样本要求高：需要高质量、高纯度的DNA模板
- 对GC-rich区域困难：高GC含量区域测序效果较差
应用领域
基因克隆验证
确认克隆的DNA片段序列是否正确，是分子克隆实验的必要步骤。
病原体鉴定
通过测序病原体的特定基因区域，进行种类鉴定和分型。
突变检测
检测已知或未知的基因突变，如遗传病相关基因的突变分析。
药物基因组学
分析与药物代谢相关的基因多态性，指导个性化用药。
法医鉴定
通过STR分型等技术进行DNA指纹分析，用于亲子鉴定和刑事侦查。
分子进化研究
通过比较不同物种的基因序列，研究生物进化关系。
与其他测序技术的比较
| 技术 | 通量 | 读长 | 准确性 | 成本 | 主要应用 |
|---|---|---|---|---|---|
Sanger测序 | 低 | 800-1000bp | 高（>99.9%） | 高 | 验证测序、小片段测序 |
第二代测序 | 极高 | 50-600bp | 中（98-99.9%） | 低 | 大规模测序、基因组学 |
第三代测序 | 高 | 10kb-2Mb | 中（90-99%） | 较高 | 长读长测序、结构变异 |
经典文献
- 1. Sanger F, Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 1975;94(3):441-448.
- 2. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(12):5463-5467.
- 3. Maxam AM, Gilbert W. A new method for sequencing DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(2):560-564.
- 4. Hood LE, Hunkapiller MW, Smith LM, et al. Automated DNA sequencing and analysis. Science. 1986;232(4752):341-347.
- 5. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001;409(6822):860-921.
